Modelli cellulari in vitro per investigare il ruolo di MYO5B nella colestasi intraepatica familiare progressiva

La Colestasi Intraepatica Familiare Progressiva (PFIC) è un gruppo di gravi malattie epatiche genetiche autosomiche recessive, caratterizzate da un difetto nella secrezione biliare che porta all’accumulo di sostanze citotossiche negli epatociti e a una progressiva insufficienza epatica. Oltre alle alterazioni dei trasportatori degli acidi biliari, studi recenti hanno evidenziato il coinvolgimento di geni implicati in altri processi cellulari fondamentali, come la polarità cellulare, il traffico vescicolare e la regolazione dell’omeostasi biliare. Tra i sottotipi più recentemente scoperti rientra la PFIC10, causata da mutazioni nel gene MYO5B, che codifica per una proteina motore essenziale per il trasporto vescicolare e la corretta polarizzazione degli epatociti. Tuttavia, i meccanismi patogenetici associati a MYO5B risultano ancora poco chiari, anche a causa della mancanza di modelli in vitro adeguati. L’obiettivo di questa tesi è stato sviluppare un modello cellulare in vitro, non invasivo e paziente-specifico, per studiare la colestasi associata a MYO5B e valutarne la modulazione molecolare. A tal fine sono state generate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da controlli sani e pazienti, a partire da cellule epiteliali isolate dalle urine e da cellule mononucleate del sangue (PBMCs), utilizzando sia metodi integrativi sia non integrativi. Inoltre, iPSCs sane sono state editate tramite tecnologia CRISPR/Cas9 per introdurre una mutazione biallelica di MYO5B. I primi tentativi di differenziamento epatico in 2D hanno prodotto cellule con caratteristiche epatocitarie, ma prive di una corretta polarizzazione. Per superare questo limite, sono stati generati organoidi epatobiliari 3D, che hanno mostrato una struttura polarizzata funzionale e la capacità di ricapitolare il trasporto biliare in vitro. Gli organoidi derivati da PBMCs di donatori sani hanno evidenziato un trasporto biliare efficiente, mentre quelli ottenuti da un paziente PFIC (chiamato HC01) hanno riprodotto i difetti funzionali tipici della malattia. Al contrario, gli organoidi derivati da iPSCs generate con metodo lentivirale integrativo hanno mostrato difetti di polarizzazione; analisi ulteriori hanno evidenziato una residua espressione dei transgeni virali, quindi queste iPSCs sono state escluse dagli esperimenti successivi. Il paziente HC01 presentava varianti in eterozigosi nei geni ABCB4, ABCB11 e MYO5B; evidenze precedenti indicano MYO5B come principale determinante patologico. Sulla base di questa ipotesi, è stato tentato un recupero funzionale mediante la veicolazione di mRNA di MYO5B wild-type incapsulato in nanoparticelle lipidiche (LNP). La somministrazione dell’isoforma di MYO5B priva dell’esone 30, predominante nel fegato, ha indotto un significativo ma transitorio ripristino del trasporto biliare mediato da BSEP. In conclusione, il lavoro ha permesso di sviluppare un modello organoide 3D paziente-specifico valido per lo studio della PFIC associata a MYO5B e ha dimostrato il potenziale terapeutico della veicolazione di mRNA tramite LNP, aprendo nuove prospettive per strategie di trattamento mirate.

Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis (PFIC) represents a group of severe autosomal recessive genetic liver diseases characterized by impaired biliary secretion, which leads to the accumulation of cytotoxic substances within hepatocytes and progressive liver failure. Beyond alterations in bile acid transporters, recent studies have highlighted the involvement of genes implicated in other fundamental cellular processes, such as cell polarity, vesicular trafficking, and the regulation of biliary homeostasis. Among the more recently discovered subtypes is PFIC10, caused by mutations in the MYO5B gene, which encodes for a motor protein essential for vesicular transport and the correct polarization of hepatocytes. However, the pathogenic mechanisms associated with MYO5B remain poorly understood, partly due to the lack of adequate in vitro models. The objective of this thesis was to develop a non-invasive, patient-specific in vitro cellular model to study MYO5B-associated cholestasis and evaluate its molecular modulation. For this aim, induced pluripotent stem cells (iPSCs) were generated from healthy controls and patients using epithelial cells isolated from urine and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), employing both integrative and non-integrative methods. Furthermore, healthy iPSCs were edited via CRISPR/Cas9 technology to introduce a biallelic MYO5B mutation. Initial attempts at 2D hepatic differentiation produced cells with hepatocyte-like characteristics but lacking proper polarization. To overcome this limitation, 3D hepatobiliary organoids were generated, which displayed a functional polarized structure and the ability to recapitulate biliary transport in vitro. Organoids derived from healthy donor PBMCs showed efficient biliary transport, whereas those obtained from a PFIC patient (designated HC01) reproduced the functional defects typical of the disease. In contrast, iPSC-derived organoids generated with integrative lentiviral method exhibited polarization defects; further analysis revealed residual expression of viral transgenes, leading to the exclusion of these iPSCs from subsequent experiments. Patient HC01 carried heterozygous variants in ABCB4, ABCB11, and MYO5B genes; previous studies indicated MYO5B as the pathological determining factor. Based on this hypothesis, functional recovery was attempted through the delivery of wild-type MYO5B mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs). The administration of the MYO5B isoform lacking exon 30 – the predominant isoform in the liver – induced a significant but transient restoration of BSEP-mediated biliary transport. In conclusion, this work enabled the development of a valid patient-specific 3D organoid model for the study of MYO5B-associated PFIC and demonstrated the therapeutic potential of mRNA delivery via LNPs, opening new perspectives for targeted treatment strategies.