Discovery of a truncated form of Cyclophilin D in human and murine mitochondrial matrix: structural and biochemical insights. Implications for mitochondrial permeability transition pore regulation.

La Ciclofilina D (CyPD), un enzima presente nella matrice mitocondriale avente attività di peptidilprolil cis-tras isomerasi, è il regolatore principale del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (PTP). Il PTP è un canale non selettivo dipendente dal calcio coinvolto nell'omeostasi del calcio (tempi di apertura brevi) ma che può risultare in una disfunzione bioenergtetica che alla fine può portare alla morte cellulare (tempi di apertura lunghi). È stato dimostrato in precedenza che CyPD interagisce con la subunità OSCP di ATP sintasi, uno dei candidati più promettenti per la formazione del PTP. In questo studio abbiamo identificato due forme di CyPD in varie linee cellulari e tessuti. L'analisi mediante spettrometria di massa ha mostrato che una forma è ~1 kDa più corta dell'altra all'estremità N-terminale, suggerendo che la CyPD possa essere tagliata da una proteasi mitocondriale. Mediante spettrometria di risonanza magnetica nucleare (NMR) abbiamo dimostrato che la CyPD umana completa (FL-CyPD) e la forma troncata all'estremità N-terminale (ΔN-CyPD) sono strutturalmente identiche, ad eccezione della coda N-terminale (assente nella forma troncata), che è altamente flessibile, in netto contrasto con la parte globulare, invece rigida. Studi in vitro utilizzando FL-CyPD e ΔN-CyPD hanno evidenziato che quest'ultima interagisce più facilmente con OSCP rispetto a FL-CyPD in un tampone a base di KCl, che meglio riflette l'ambiente fisiologico della matrice. Analogamente, studi di elettrofisiologia hanno mostrato che la forma ΔN-CyPD, anche in assenza di fosfato, è in grado di attivare rapidamente l'apertura del PTP in risposta al trattamento con il calcio preparazioni altamente purificate di ATP sintasi da cuore bovino. Tramite NMR abbiamo infine dimostrato che la regione regolatoria S2 di CyPD, possibilmente coinvolta nel legame con OSCP, è influenzata dal KCl. In particolare, abbiamo osservato che il KCl induce variazioni conformazionali nella regione S2 sia di FL-CyPD che di ΔN-CyPD. D'altra parte, l'analisi della forma della linea ha rivelato che il KCl influenza ampiamente la dinamica di FL-CyPD ma non di ΔN-CyPD, in particolare nei residui N-terminali mancanti nella forma troncata e nella regione S2. Nel complesso, questo spiegherebbe in modo meccanicistico come le due proteine, nonostante siano molto simili da un punto di vista strutturale, si comportino in modo diverso in ambienti simil-fisiologici. Nel complesso, i nostri dati suggeriscono la presenza di una CyPD troncata all'estremità N-terminale che si comporta in modo diverso rispetto a FL-CyPD, offrendo nuovi spunti sulla regolazione del PTP.

Mitochondrial Cyclophilin D (CyPD), endowed with peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity, is a master regulator of the mitochondrial permeability transition pore (PTP). PTP is a Ca2+-dependent, unselective channel involved in mediating fast Ca2+release from mitochondria (short open times) and in generating a bioenergetic failure eventually leading to cell death (long open times). It was previously demonstrated that CyPD interacts with the OSCP subunit of ATP synthase, one of the most promising candidate for forming the PTP. In this study we identified two forms of CyPD in various cell lines and tissues. Mass spectrometry analyses showed that one form is ~1 kDa shorter than the other at the N-terminus, suggesting that CyPD could be cleaved by a mitochondrial protease. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy revealed that the human full-length CyPD (FL-CyPD) and a N-terminal truncated form (ΔN-CyPD) are structurally identical, except for the N-terminal tail (absent in the truncated form), which is highly flexible, in sharp contrast with the remaining globular rigid part. In vitro studies using FL-CyPD and ΔN-CyPD highlighted that the latter more avidly interacts with OSCP than the FL-CyPD in a KCl buffer, which best resembles the physiological environment. Consistently, electrophysiological studies showed that only ΔN-CyPD in the absence of the phosphate rapidly triggers PTP opening in response to Ca2+ treatment in highly purified bovine heart ATP synthase. NMR proved that the regulatory region S2 of CyPD, possibly involved in OSCP binding, is affected by KCl. Specifically, we observed that KCl induces conformational variations at the S2 of both FL-CyPD and ΔN-CyPD. Furthermore, lineshape analysis revealed that KCl extensively affects the dynamcis of FL-CyPD but not ΔN-CyPD, specifically at the N-terminal residues missing in the truncated form and at the S2. Altogether, this would explain mechanistically how the two proteins, despite being highly similar, behave differently in KCl-based media. Overall, our data suggest the presence of a N-terminally cleaved CyPD that behaves differently than FL-CyPD, which offers new insights into PTP regulation.