DEALING WITH THE MAIN CHALLENGES OF FANCONI ANEMIA MOLECULAR DIAGNOSIS AND THERAPY

L’anemia di Fanconi (Fanconi anemia, FA) è una sindrome genetica rara causata da un difetto nella riparazione del danno al DNA con ampia eterogeneità genetica, numerose mutazioni private ed elevato tasso di mosaicismo. Tali fattori compromettono tuttora la formulazione di una diagnosi molecolare in caso di varianti di difficile caratterizzazione o significato patogenetico incerto. La FA è caratterizzata da aplasia midollare e un’aumentata suscettibilità allo sviluppo di tumori ematologici e solidi. Dato che i trattamenti attualmente disponibili si rivolgono ai soli difetti ematopoietici, è essenziale identificare nuove terapie farmacologiche sistemiche per il trattamento dei pazienti FA. Abbiamo cercato di far fronte a tali criticità mediante: i. Progettazione di una strategia di screening mutazionale ottimizzata basata sul sequenziamento mirato di nuova generazione (targeted next generation sequencing, t- NGS) e su tecniche complementari per una diagnosi molecolare di FA più rapida ed esaustiva. ii. Validazione di sistemi cellulari basati sull’espressione di tre proteine FANCA mutanti, ma stabili (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del), per uno screening ad alto contenuto di farmaci (high content screening, HCS) al fine di trovare molecole capaci di correggerne il fenotipo aberrante. iii. Realizzazione di clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) knockout (KO) screening su scala genomica per identificare nuove interazioni sintetiche (synthetic interactions, SIs) con i geni FA. Il conseguimento degli obiettivi di questo progetto di tesi fornirà una strategia comprensiva per le attuali sfide poste dalla FA, procedendo dal laboratorio al letto del paziente e viceversa.

Fanconi anemia (FA) is a rare genetic DNA repair deficiency with vast genetic heterogeneity, multiple private mutations, and high mosaicism rate, still jeopardizing molecular diagnosis in case of variants with difficult characterization or unclear pathogenicity. FA also shows bone marrow failure and enhanced susceptibility to hematologic and solid malignancies. Since current treatments only address hematopoietic defects, it is essential to find new systemic drug-based therapies for FA patients. We sought to cope with these hurdles through: i. Design of an optimized mutation screening strategy based on targeted next generation sequencing and complementary techniques for a faster and exhaustive FA molecular diagnosis. ii. Validation of cellular systems expressing three stable, but defective FANCA proteins (Arg951Gln, Thr1131Ala, Phe1263del) suitable for high content screening (HCS) to identify drug/s able to rescue mutants’ phenotypes. iii. Performance of genome-wide (GW) clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) knockout (KO) screens to dissect novel synthetic interactions (SIs) with FA deficiency. The achievement of the goals of this thesis project will provide a comprehensive strategy for the current challenges of FA, proceeding from the bench to the bedside and back.