Functional characterization of the biofilm exopolysaccharide produced by Burkholderia multivorans C1576

L’attività di ricerca è stata focalizzata sulla delucidazione del ruolo strutturale e funzionale giocato dall’esopolisaccaride EpolC1576 sintetizzato e secreto nella matrice del biofilm da Burkholderia multivorans C1576, un patogeno opportunista isolato da malati di fibrosi cistica. La formazione del biofilm potrebbe essere una delle cause del cronicizzarsi delle infezioni nei malati di fibrosi cistica anche perché i biofilm sono considerati dei fattori di virulenza che conferiscono tolleranza e resistenza agli agenti antimicrobici. I biofilm sono aggregati polimicrobici costituiti da cellule batteriche immerse in una matrice altamente idratata di biopolimeri da loro prodotti e in cui gli esopolisaccaridi sono generalmente la componente preponderante. A differenza della gran parte degli esopolisaccaridi batterici caratterizzati finora, che risultano essere polimeri altamente idrofilici, l’EpolC1576 mostra un interessante carattere anfifilico. Esso risulta costituito da una unità tetrasaccaridica contenente mannosio e ramnosio in quantità equimolari. L’assenza di un idrossile al carbonio 6 del ramnosio insieme alla presenza di un metossile al carbonio 3 del 50% dei ramnosi legati in posizione 2, conferisce un carattere anfipatico all’EpolC1576 che potrebbe essere cruciale per la formazione ed il mantenimento del biofilm, ma anche per la diffusione di piccole molecole apolari come le molecole segnale del quorum sensing (QS), attraverso l’ambiente acquoso della matrice. La capacità dell’EpolC1576 di interagire con sonde fluorescenti idrofobiche è stata dimostrata attraverso analisi di spettroscopia di fluorescenza e di risonanza magnetica nucleare (NMR). Mediante quest’ultima è stato anche possibile dimostrare che l’EpolC1576 è in grado di aumentare la solubilità di una molecola segnale del QS conosciuta come Fattore Diffusibile del Segnale (DSF). Simulazioni di dinamica molecolare hanno rivelato che l’EpolC1576 è una molecola molto flessibile in grado di ripiegarsi ed allungarsi rapidamente, ma hanno anche confermato la presenza di interazioni significative tra l’EpolC1576 e il DSF. Analisi di spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) hanno mostrato che l’EpolC1576 è in grado di legare con buona affinità catene alifatiche immobilizzate su un supporto d’oro in funzione della concentrazione di esopolisaccaride utilizzata. Analisi di trasferimento di magnetizzazione (STD NMR) hanno provato che l’EpolC1576 interagisce con l’antibiotico Kanamicina. La conformazione dell’EpolC1576 è stata studiata mediante microscopia a forza atomica (AFM) ed ha rivelato che l’esopolisaccaride dà origine a degli aggregati tridimensionali densamente popolati grazie all’adozione di una conformazione compatta da parte delle catene glucidiche. Parallelamente, l’analisi al microscopio confocale a scansione laser (CLSM) ha prodotto ulteriori informazioni riguardo la morfologia ed la composizione del biofilm di B. multivorans C1576 formatosi in tre terreni diversi. L’analisi della matrice del biofilm al microscopio a trasmissione elettronica ha evidenziato la presenza di vescicole di membrana esterna (OMVs), mentre l’identità delle proteine associate alla matrice del biofilm e alle OMVs è stata svelata mediante analisi di spettrometria di massa. Infine, una libreria fagica di sequenze di DNA genomico di B. multivorans C1576 è stata analizzata per individuare proteine in grado di legare l’EpolC1576.

The research is focused on the elucidation of the structural and functional role played by the exopolysaccharide EpolC1576 produced by the opportunistic pathogen Burkholderia multivorans C1576, a cystic fibrosis isolate, and excreted in the biofilm matrix. Biofilm formation might be the cause of chronic infections in cystic fibrosis subjects as biofilms are recognized virulence factors conferring tolerance and resistance to antimicrobials. Biofilms are poly-microbial aggregates in which cells are encased in a self-produced matrix of highly hydrated biopolymers with exopolysaccharides (Epols) being usually the most abundant component. Unlike most of the bacterial Epols characterized so far, which are highly hydrophilic, EpolC1576 shows an interesting amphipathic character. It is made up of a tetrasaccharide repeating unit, containing D-mannose and D-rhamnose. The lack of the primary alcohol group on carbon 6 of rhamnoses together with the presence of a methoxy substituent on carbon 3 confer to EpolC1576 an amphipathic character that might be necessary for biofilm formation and maintenance, but also for the diffusion of small nonpolar compounds, such as quorum sensing (QS) signal molecules, through the matrix aqueous gel-like structure. The ability of EpolC1576 to interact with hydrophobic fluorescent probes was demonstrated via both fluorescence and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. NMR analysis also proved the EpolC1576 capability to increase the solubilization of the hydrophobic QS molecule known as Diffusible Signal Factor (DSF). Molecular modelling calculations revealed that EpolC1576 has a very flexible chain that can rapidly bend and straighten, but also confirmed the presence of significant interactions between EpolC1576 and the DSF molecule. Interestingly, surface plasmon resonance spectroscopy analysis showed the EpolC1576 binding to a monolayer of aliphatic chains in a concentration dependent manner. Saturation transfer difference NMR proved EpolC1576 interactions with the aminoglycoside antibiotic Kanamycin. The morphology of EpolC1576 was investigated by atomic force microscopy suggesting that the exopolysaccharide can form three dimensional structures, consisting of packed compact coils. In parallel, confocal laser scanning microscopy imaging of B. multivorans C1576 biofilms brought additional information about biofilm morphology and composition. Transmission electron microscopy analysis revealed that outer membrane vesicles represent a component of the biofilm matrix, whereas a comprehensive proteomic study to identify the nature of proteins dwelling within the biofilm matrix was carried out. Finally, a phage library of genomic DNA sequences obtained from B. multivorans C1576 was screened to seek for proteins possibly interacting with EpolC1576.