PRMT6 : identification and characterization of new molecular partners

The Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6) is an enzyme characterized by a predominant nuclear localization and automethylation activity. Until today, very few information are known about its function and its substrates. To better characterize PRMT6, we looked for new partners and substrates, using the yeast two-hybrid system. This technique allowed us to discover 36 new partners for this enzyme, 19 of these interactions were confirmed with the GST Pull-down assay. Among these partners, 9 resulted to be interactors also for HMGA protein, a chromatin architectural factor that has been previously demonstrated to be an in vivo substrate of PRMT6. The binding between partners and PRMT6 was further assessed in vivo in mammalian cells, and out of nine proteins tested, 7 were confirmed. To test whether among the identified partners there were substrates, we performed an in vitro methylation assay, and discovered 4 new substrates of this enzyme (Macrophage migration inhibitory factor, Human DnaJ homologue, Small nuclear ribonucleoprotein-associated proteins B and B’, and Tubulin beta-2A chain). Moreover, we evaluated if the presence of HMGA1a, could modulate the methylation activity of PRMT6. We demonstrated that MIF’s methylation was enhanced in the presence of HMGA1a protein. Furthermore, to evaluate a possible role played by HMGA, MIF, and PRMT6 together, we studied the effect of MIF on Cyclin A (CycA) promoter. We choose this reporter because it is known the activation effect of HMGA2 protein on this promoter. Our data demonstrated that both MIF and PRMT6 could activate this promoter, but the simultaneous presence of these two proteins result in a lower activation, suggesting that PRMT6 had a negative effect on MIF function. PRMT6 è una Protein Arginine Methyltransferase caratterizzata da una localizzazione prevalentemente nucleare e capacità di autometilazione. Ad oggi, poche informazioni sono note circa la sua funzione ed i suoi substrati. Per meglio caratterizzare questo enzima, abbiamo cercato nuovi partners e substrati utilizzando il sistema del doppio ibrido in lievito. Questa metodica ci ha permesso di identificare 36 nuovi interattori. Per 19 di questi, l’interazione è stata confermata anche in GST Pull-down, e 9 sono risultati essere partners in comune anche con la proteina HMGA, un fattore architetturale della cromatina che è stato precedentemente dimostrato essere metilato in vivo da PRMT6. Successivamente, per 7 dei 9 interattori testati, il legame con PRMT6 è stato confermato anche in vivo in cellule di mammifero. Per testare se tra i vari partners identificati ci fossero anche dei substrati, abbiamo effettuato un esperimento di metilazione in vitro che ha portato all’identificazione di 4 nuovi substrati di PRMT6 (Macrophage migration inhibitory factor, Human DnaJ homologue, Small nuclear ribonucleoprotein-associated proteins B and B’, and Tubulin beta-2A chain). Abbiamo inoltre valutato se la presenza di HMGA1a potesse modulare l’attività di metilazione di PRMT6 e abbiamo dimostrato che la metilazione di MIF aumentava in presenza di HMGA1a. Inoltre, per valutare il possibile ruolo di HMGA, MIF e PRMT6 insieme, abbiamo studiato l’effetto di MIF sul promotore della Ciclina A. E’stato scelto proprio questo promotore in quanto è noto essere attivato della proteina HMGA2. Con i nostri esperimenti abbiamo dimostrato che sia MIF che PRMT6 possono attivarlo, ma la simultanea presenza di queste due proteine risulta in un’attivazione meno forte, suggerendo un effetto negativo per PRMT6 su MIF.