Isolation of mitochondria and quantification of mitochondrial DNA damage; analysis of the relationship between APE1/Ref-1 mitochondrial localization and clinical-pathological charateristics in human hepatocellular carcinoma

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common cancer worldwide. Advances in diagnosis have improved the prognosis of HCC patients but it remains a life threatening tumor where somatic mitochondrial DNA (mtDNA) mutations have been suggested to cause mitochondrial dysfunction and promote tumor growth. Biomedical research relies on the use of animal models and human derived tissues for the study of human pathologies. Here we describe a protocol that enables the simultaneous purification of mitochondria and nuclei from mouse liver and from human HCC biopsies and the quantification of mtDNA damage in HCC. In this regard, we demonstrated that in contrast to the currently used quantitative PCR protocol, in which mtDNA is not separated from genomic DNA, it is necessary to use a purified mtDNA template to obtain reliable data on the levels of mtDNA damage in tumor-derived tissues. We also study the mutual relationships between expression of APE1/Ref-1 in tumoral mitochondria and nuclei, mtDNA damage and clinical- pathological characteristics in patients with hepatocellular carcinoma (HCC), looking for a possible prognostic role of APE1/Ref-1 subcellular localization in HCC tumors. Collectively, these data suggest a possible role of APE1/Ref-1 overexpression in the development of the HCC and indicate that the subcellular localization of APE1/Ref-1 in HCC tissue might be used as a prognostic marker for this worldwide tumor and index of sensitivity to surgical, ablative or chemotherapy treatments

Il carcinoma epatocellulare (HCC) rappresenta la quinta causa di morte per tumore nel mondo. I traguardi raggiunti nella diagnostica strumentale hanno migliorato la prognosi dei pazienti affetti da HCC, che rimane severa ove siano presenti mutazioni somatiche del DNA mitocondriale (mtDNA) che sono state indicate come causa di disfunzione mitocondriale e promotrici della crescita tumorale. La ricerca biomedica si basa sull'impiego di modelli animali e derivati di tessuti umani per lo studio di patologie umane. In questo articolo viene descritto un protocollo che consente di eseguire simultaneamente la purificazione di mitocondri e di nuclei, provenienti da fegato di topo e da biopsie di noduli di carcinoma epatico umano, e di quantificare il danno negli HCC (mtDNA). A questo proposito, abbiamo dimostrato che in contrasto con gli attuali protocolli sull’uso della PCR quantitativa, in cui in cui mtDNA non è separato dal DNA genomico, è necessario utilizzare un modello mtDNA purificato per ottenere dati affidabili sui livelli di danno mtDNA danneggiato nei tessuti di derivazione tumorale