Nel corso di questo lavoro e stato ottimizzato un metodo per ottenere –mediante idrolisi acquosa- campioni di DNA danneggiati in maniera controllata (r2= 0.997). Uno di questi campioni, denominato trial sample (TS), veniva sottoposto ad un esperimento interlaboratorio (n=25) nel corso del quale ogni partecipante doveva fornire dati relativi alla quantificazione del campione ed al suo l’assetto genotipico.
L’impiego della qPCR ha dimostrato che, in campioni danneggiati, e possibile fornire
solo una indicazione che e relativa (ed inversamente proporzionale) alla lunghezza
(r2=0.891) della regione target. Circa i genotipi forniti, veniva osservato che, a causa di un’elevata frequenza di artefatti di PCR, l’esecuzione di un basso numero di tre repliche(≤ 3)puo portare ad errori(n=4. Lo sviluppo del metodo “consensus TSPV", invece,eliminava tali errori di genotipizzazione.
L’utilizzo di tale metodo di “consensus” ha dimostrato che, per campioni degradati ed in
condizione di Low Copy Number (≤ 96 pg/PCR), neanche l’esecuzione di sette repliche mette totalmente al riparo da errori di genotipizzazioni.Anche la tecnologia Illumina di Next Generation Sequencing e stata testata mediante un set di campioni danneggiati. Pure la fedeltà di questa tecnologia e stata molto influenzata dalla qualità del templato. Il“consensus TSPV”, inoltre, evidenziava che errori di genotipizzazione possono emergere quando vengono eseguite due sole repliche.
Il maggiore limite dell’analisi forense sembra derivare proprio dall’elevatissima
sensibilità analitica oggi ottenibile. In the course of this work has been optimized a method to obtain -by hydrolysis in water- damaged DNA samples in a controlled manner (r2=0.997). One of these samples, called trial sample (TS), was subjected to an inter-laboratory experiment
(n=25)during which each participant had to provide data on the quantification of the
sample and its trim genotype.
The use of the qPCR showed that, in damaged samples, it is possible to provide only an indication that is relative (and inversely proportional) to the length (r2=0891)of the target region. About the genotypes provided, was observed that, due to a high frequency of PCR artifacts, the execution of a low number of three replicates (≤3)may lead to errors (n=4). Method development "consensus TSPV", instead, eliminated these errors genotyping.
The use of this method "consensus" has shown that, for degraded samples and under Low Copy Number conditions (≤96pg/PCR),even the execution of seven replicas puts totally immune from errors in genotyping. Even Illumina technology of Next Generation Sequencing was tested using a set of damaged samples. Even the fidelity of this technology has been very influenced by the quality of the template. The "consensus TSPV" also showed that genotyping errors can arise when running only two replicas.
The major limitation of the forensic analysis seems to derive just by the very high analytical sensitivity obtainable today.
