Prot. P2022ZWY8H - PRIN-UNO - Prolyl isomerase PIN1 inhibitors: a drug design strategy against aggressive tumors

Le modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine sono cruciali per le risposte cellulari a stimoli intra- ed extra-cellulari. Una PTM cruciale nella trasduzione del segnale è fornita dall'isomerizzazione cis-trans dipendente dalla fosforilazione dei motivi fosforilati Ser/Thr-Pro, che comporta cambiamenti conformazionali che influenzano la struttura di specifici domini con impatto sulla funzione proteica. Negli esseri umani, l'unico enzima conosciuto che isomerizza specificamente i motivi fosfo-Ser/Thr-Pro è la peptidil-prolil isomerasi Pin1. Elevati livelli di Pin1 sono prevalenti nei tumori, e noi e altri abbiamo scoperto che modula molteplici pathway di segnalazione rilevanti per la crescita, la metastasi e la resistenza al trattamento del cancro. L'attivazione anomala di Pin1 aumenta contemporaneamente più oncogeni, mentre la deplezione o l'inibizione farmacologica di Pin1 in modelli sperimentali con topi arresta la crescita e la metastasi del tumore, rendendo Pin1 un bersaglio ideale per i farmaci. Pertanto, considerevoli sforzi sono stati fatti per lo sviluppo di terapie mirate a Pin1, tuttavia gli inibitori forniti principalmente mostrano bassa potenza, specificità, stabilità e permeabilità. Un programma di ricerca dedicato alla progettazione di inibitori di Pin1 è attivo nel nostro consorzio dal 2015. Tale programma ha già identificato KPT-6566, un potente inibitore di Pin1 in grado di forzarne la degradazione. Agendo come inibitore covalente, mostra un'attività antitumorale significativa in topi nude (5 mg/kg, iniezione ip). Negli ultimi anni, il nostro programma di sviluppo di farmaci ha identificato altri nuovi composti capaci di inibire Pin1 con la stessa potenza dell'acido all-trans retinoico (ATRA), uno degli inibitori specifici di Pin1 più studiati. I composti potrebbero essere raggruppati in due categorie: analoghi di ATRA e chimiotipi di pirazolo derivati dallo screening della libreria di UniTO. Questa proposta è dedicata all'identificazione di nuovi inibitori di Pin1, caratterizzati fino al livello preclinico. Perseguiremo una campagna di ottimizzazione del lead, utilizzando un approccio computazionale basato sulla struttura, a partire dai hits descritti sopra. Applicheremo un ciclo iterativo di ottimizzazione, supportando il processo di ottimizzazione del farmaco mediante studi strutturali e analisi in silico all'avanguardia. I migliori candidati saranno quindi valutati per il profilo metabolico in vitro e la stabilità nei fluidi biologici. L'attività antitumorale dei migliori composti verrà indagata in modelli 2D e 3D di cancro al seno (colture 2D, sferoidi derivati dal tumore e organoidi derivati da topi e pazienti). Una volta identificate le molecole guida, verranno valutati la tossicità e il profilo farmacocinetico nei topi. Le analisi verranno eseguite sfruttando tecnologie avanzate di biosampling miniaturizzate e di trattamento dei campioni accoppiate a metodi originali basati su spettrometria di massa, al fine di ridurre volumi di campione, solventi e reagenti, nel quadro generale della sostenibilità.

Post-translational modifications (PTMs) of proteins are critical for appropriate cellular responses to intra- and extra-cellular stimuli. A crucial PTM in signal transduction is provided by phosphorylation-dependent cis-trans prolyl isomerization of phosphorylated Ser/Thr-Pro motifs, which results in conformational changes affecting the structure of specific domains with impact on protein Ministero dell'Università e della Ricerca MUR - BANDO 2022 PNRR function. In humans, the only known enzyme that specifically isomerizes phospho-Ser/Thr-Pro motifs is the peptidyl-prolyl isomerase Pin1. High Pin1 levels are prevalent in tumors,1 and we and others found that it modulates multiple signaling pathways relevant for cancer growth, metastasis, and treatment resistance.2 Abnormal Pin1 activation simultaneously boosts multiple oncogenes, while depletion or pharmacological inhibition of Pin1 in experimental mouse models curbs tumor growth and metastasis, making Pin1 an ideal drug target.3 Thus, considerable effort for developing Pin1 target therapies has been made, yet the provided inhibitors mainly display low potency, specificity, stability, and permeability.2, 4 A research program dedicated to designing Pin1 inhibitors is active in our consortium since 2015. Such program already identified KPT-6566, a potent Pin1 inhibitor able to force its degradation. Acting as covalent inhibitor, it exhibits significant antitumor activity in nude mice (5 mg/kg, ip injection).5 In recent years, our drug development program identified other new hits able to inhibit Pin1 with the same potency of all-trans retinoic acid (ATRA), one of the most studied Pin1 specific inhibitor.6 The hits could be clustered into two groups: ATRA analogs and pyrazole chemotypes derived from UniTO library screening. This proposal is dedicated to identifiy new Pin1 inhibitors, characterized up to preclinical level. We will pursue a lead optimization campaign, by using a structure-based computationally driven approach, starting from the above-described hits (see preliminary results). We will apply an iterative optimization cycle, supporting the drug optimization process by structural studies and state of the art in silico analysis. The best candidates will be then evaluated for in vitro metabolic profile and stability in biological fluids. Antitumor activity of the best compounds will be investigated in 2D and 3D models of breast cancer (2D cultures, tumor-derived spheroids and mouse- and patient-derived organoids). Once the lead molecule(s) will be identified, toxicity and pharmacokinetic profile in mice will be endorsed. Analysis will be performed exploiting advanced miniaturized biosampling and sample treatment technologies coupled to original mass spectrometry-based methods7 in order to reduce sample volumes, solvents and reagents, in the general framework of sustainability.