Prot. P2022EZ9LN - A chemo-optogenetic nanosensor for the control of drug-resistant epilepsy (pH4Health)

L'epilessia è un disturbo neurologico caratterizzato da convulsioni ripetute. Sono disponibili diversi approcci terapeutici ma, purtroppo, circa il 30% dei pazienti non risponde alle terapie mediche. Nell'ultimo decennio, l'optogenetica è emersa come strumento sia per esplorare le dinamiche delle reti neuronali che per trattare condizioni neurologiche come l'epilessia. La strategia optogenetica si basa sull'espressione, in precise aree del cervello, di proteine sensibili alla luce chiamate opsine che sono in grado di modificare il potenziale di membrana in base all'illuminazione specifica della lunghezza d'onda, solitamente ottenuta utilizzando hardware basato su LED. Nonostante i numerosi vantaggi di questa tecnica, la ricerca deve ancora affrontare sfide pratiche e traslazionali a causa delle difficoltà di illuminare aree multiple e profonde del cervello. In questo scenario, la ricerca di sorgenti luminose alternative è un obiettivo da raggiungere. Le luciferasi sono enzimi in grado di emettere luce dopo l'aggiunta del proprio substrato celenterazina e possono essere utilizzate per fornire luce alle opsine e modulare la loro azione. In questo progetto, miriamo a sviluppare un sensore closed-loop chiamato pHIL (luminopsina inibitoria sensibile al pH) con lo scopo di inibire la generazione di crisi epilettiche. pHIL è composto da una proteina bioluminescente, RLuc8, accoppiata all'opsina inibitoria eNpHR3.0. Nella strategia proposta, il controllo delle convulsioni avverrà solo nelle condizioni acide intracellulari osservate nei neuroni epilettici. La sensibilità del pH della sonda è data da un sensore di pH, una variante sensibile al pH dell'EGFP, chiamato E2GFP. Il funzionamento della sonda si basa sul meccanismo BRET: la luce UV prodotta dalla luciferasi viene trasferita all'E2GFP che in condizioni acide emetterà luce e attiverà l'eNpHR3.0, favorendo l'iperpolarizzazione della membrana dei neuroni epilettici. I nostri dati preliminari mostrano che il sensore pHIL è espresso e si localizza sulla membrana plasmatica nelle cellule HEK293T e nei neuroni ippocampali primari. Inoltre, pHIL iperpolarizza le cellule HEK293T in condizioni di acidità extracellulare e per aggiunta di CTZ 400a, lo specifico substrato della luciferasi in grado di indurre l'emissione di luce UV. Sulla base dei nostri dati, quindi, proponiamo pHIL come potenziale strumento terapeutico per contrastare l'ipereccitabilità neuronale.

Epilepsy is a neurological disorder characterized by repeated seizures. Different therapeutic approaches are available but, unfortunately, about 30% of patients do not respond to medical therapies. Over the past decade, optogenetics has emerged as a tool for exploring the dynamics of neuronal networks and treating neurological conditions such as epilepsy. The optogenetic strategy is based on the expression, in precise areas of the brain, of light-sensitive proteins called opsins that are capable of modifying the membrane potential according to the specific wavelength illumination, usually obtained using computer-based hardware. Despite the numerous advantages of this technique, research still faces practical and translational challenges due to the difficulties of illuminating multiple and deep areas of the brain. In this scenario, the search for alternative light sources is a goal to be achieved. Luciferases are enzymes capable of emitting light upon addition of their substrate coelenterazine and can be used to provide light to opsins and modulate their action. In this project, we aim to develop a closed-loop sensor called pHIL (pH-sensitive inhibitory luminopsin) with the aim of inhibiting the generation of seizures. pHIL is composed of a bioluminescent protein, RLuc8, coupled to the inhibitory opsin eNpHR3.0. In the proposed strategy, seizure control will occur only under the acidic intracellular conditions observed in epileptic neurons. The pH sensitivity of the probe is provided by a pH sensor, a pH sensitive variant of EGFP, called E2GFP. The functioning of the probe is based on the BRET mechanism: the UV light produced by the luciferase is transferred to E2GFP, which in acidic conditions will emit light and activate eNpHR3.0, favoring the hyperpolarization of the epileptic neuron membrane. Our preliminary data show that the pHIL sensor is expressed and localized to the plasma membrane in HEK293T cells and primary hippocampal neurons. Furthermore, pHIL hyperpolarizes HEK293T cells under conditions of extracellular acidity and upon addition of CTZ 400a, the specific substrate of luciferase capable of inducing the emission of UV light. Based on our data, therefore, we propose pHIL as a potential therapeutic tool to counteract neuronal hyperexcitability.