Prot. 2022FSPCH2 - Dissecting the oxinflammatory mechanisms involved in Rett Syndrome pre-symptomatic/symptomatic switch: focus on mitochondria and inflammasome activation

La sindrome di Rett (RTT) è una malattia genetica progressiva del neurosviluppo causata principalmente da mutazioni sporadiche nel gene MECP2, localizzato nel cromosoma X (Amir 2000, Kyle 2017). L'ablazione neuronale di MeCP2 causa disfunzioni sinaptiche e morfologiche che sono la causa patogena primaria nella RTT (Pohodich 2015). Anche prima del riconoscimento delle cause genetiche della RTT, i risultati clinici hanno suggerito la presenza di anomalie metaboliche e più recentemente disfunzioni mitocondriali e la presenza di uno stato infiammatorio subclinico sono state identificate come importanti contributori alla fisiopatologia della RTT (Eeg-Olofsson 1988, 1990 ; Shulyakova 2017). In effetti, è stato riportato che i mitocondri delle biopsie muscolari e del lobo frontale di pazienti con RTT presentano un'ultrastruttura anormale determinata dalla microscopia elettronica (Armstrong 1992, Bauman 1995). Inoltre, queste osservazioni sono state corroborate dal profilo di espressione genica di pazienti RTT e campioni di topi knockout per Mecp2 che mostravano un'espressione alterata dei geni necessari per la struttura, la funzione e l'omeostasi redox dei mitocondri (Filosa 2015, Pecorelli 2016). Questi difetti sono stati proposti per contribuire ulteriormente alla progressione della malattia (Grosser 2012, Sbardella 2017).Oltre all'aumento dei marcatori correlati al danno ossidativo e alla ridotta attività dei principali enzimi antiossidanti (Pecorelli et al., 2011; Cervellati et al., 2015), i pazienti con RTT mostrano una condizione infiammatoria subclinica cronica caratterizzata da deregolazione delle proteine ​​di risposta di fase acuta e citochine perturbate /profilo delle chemochine (Cortelazzo et al., 2014; Leoncini et al., 2015; Pecorelli et al., 2016). Inoltre, le PBMC RTT presentano anomalie morfologiche mitocondriali associate alla sovraregolazione dell'mRNA dell'arachidonato 15-lipossigenasi (ALOX15), un enzima implicato nell'ossidazione degli acidi grassi polinsaturi tra cui l'acido linoleico e nella generazione di metaboliti lipidici bioattivi come gli acidi idrossiottadecadienoici (HODE) ( Pecorelli et al., 2016; Pecorelli et al., 2019). I livelli di trascrizione di ALOX15 sono correlati ai livelli sierici aumentati di 13-HODE nei pazienti con RTT (Pecorelli et al., 2019). Anche le popolazioni di macrofagi, inclusa la microglia, sono disregolate nei topi Mecp2-null (Cronk et al., 2015; Schafer et al., 2015). Uno studio trascrittomico sulla microglia di topi femmine Mecp2-null negli stadi prefenotipici e fenotipici ha rivelato un'espressione alterata dei geni associati all'immunità innata e alle risposte allo stress cellulare, suggerendo un potenziale ruolo precoce della microglia nella successiva insorgenza di sintomi neurologici (Zhao et al., 2017). In questo contesto, i mitocondri possono svolgere un ruolo chiave nell'alimentare questo dialogo incrociato di feedback positivo tra l'omeostasi redox alterata e l'aumento dello stato infiammatorio (OxInflammation) RTT (Pecorelli et al., 2016).Ad esempio, la disfunzione mitocondriale è considerata cruciale per l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3, un complesso multiproteico che media le risposte proinfiammatorie (Sandhir et al., 2017). Come parte della difesa immunitaria innata, gli inflammasomi possono svolgere un ruolo cruciale in questa condizione infiammatoria cronica. Gli inflammasomi sono un gruppo di complessi multiproteici intracellulari assemblati in risposta a diversi stimoli (sia patogeni che fattori di stress sterili) e caratterizzati dall'attivazione di caspasi infiammatorie (caspasi-1, -4, -5 e -11), in grado di attivare le citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18. È stata identificata una varietà di complessi inflammasoma distinti, tuttavia il più caratterizzato è il complesso NLRP3, che comprende nella sua forma canonica la proteina sensore "dominio pirina della famiglia NLR contenente 3" (NLRP3), la proteina adattatrice "simile a uno speck associato all'apoptosi proteina contenente un dominio di attivazione e reclutamento della caspasi' (ASC) e la proteina effettrice pro-caspasi-1 (Liu et al., 2020). L'inflammasoma NLRP3 viene generalmente attivato attraverso un processo in due fasi. Durante la fase di priming (segnale 1), all'attivazione di diversi recettori (ad es. TLR4) indotti da pattern molecolari associati a patogeni o danni (rispettivamente PAMP e DMAP), NF-κB si trasloca nel nucleo, dove può trascrivere per diversi geni tra cui NLRP3, pro-IL-1β e pro-IL-18. L'attivazione di NLRP3 può avvenire attraverso una moltitudine di segnali (PAMPs/DAMPs, efflusso di potassio, fattori ambientali dannosi per i lisosomi e fattori endogeni, come l'eccessiva produzione di ROS e il danno mitocondriale), portando all'assemblaggio del macchinario e alla scissione autocatalitica di pro-caspase-1 nella sua forma attiva (segnale 2). La caspasi-1 non solo è responsabile dell'attivazione e del rilascio di IL-1β e IL-18, ma può anche scindere la proteina D della gasdermina e il suo frammento N-terminale che può creare pori nella membrana plasmatica e alla fine innescare un tipo pro-infiammatorio di morte cellulare nota come piroptosi (Liu et al., 2020). L'assemblaggio del sistema inflammasoma NLRP3 porta ad una cascata di eventi in grado di promuovere una moltitudine di risposte immunitarie finemente regolate utili al ripristino delle condizioni fisiologiche. Tuttavia, un'attivazione incontrollata e prolungata dell'inflammasoma può partecipare all'insorgenza e alla progressione di stati infiammatori cronici associati a diverse malattie umane (come cancro, gotta, diabete di tipo II, malattie neurodegenerative e autismo) (Saresella et al., 2016; Moossavi et al., 2018; Song et al., 2017). Abbiamo recentemente riscontrato un'attivazione disregolata dell'inflammasoma in cellule primarie ottenute da pazienti con RTT (Pecorelli et al., 2020; Cordone et al., 2022). È interessante notare che l'aumento dei livelli plasmatici di IL-1β e IL-18 ha mostrato, rispettivamente, una correlazione positiva con la gravità della mutazione MECP2 e una correlazione negativa con lo stadio della patologia, suggerendo un ruolo per una risposta aberrante dell'inflammasoma nella fisiopatologia della RTT, anche nelle fasi iniziali di malattia (Cordone et al., 2022). Sulla base della letteratura e dei risultati sopra descritti, ipotizziamo che la dinamica mitocondriale alterata e uno stato iperattivato costitutivo dell'inflammasoma NLRP3 possano svolgere un ruolo critico nella condizione "OxInflammatory" tipica della RTT. In particolare, in questo progetto, vogliamo dimostrare il loro ruolo di contributo nel passaggio dallo stadio presintomatico a quello sintomatico caratteristico della RTT. In questo contesto, le future indagini sulle terapie che affrontano la disfunzione mitocondriale hanno un impatto clinico potenzialmente ampio sull'RTT poiché la dinamica mitocondriale alterata e l'attivazione dell'inflammasoma sono eventi causalmente correlati. Infatti, la dinamica mitocondriale difettosa promuove la localizzazione mitocondriale di NLRP3 e l'attivazione dell'inflammasoma (Mishra et al., 2021). Pertanto, i trattamenti che ripristinano l'omeostasi mitocondriale e lo stato infiammatorio subclinico potrebbero essere obiettivi chiave per migliorare l'esito del paziente.

Rett syndrome (RTT) is a genetic, progressive neurodevelopmental disorder mainly caused by sporadic mutations in the MECP2 gene, located in the X chromosome (Amir 2000, Kyle 2017). Neuronal MeCP2 ablation causes synaptic and morphological dysfunctions that are the primary pathogenic cause in RTT (Pohodich 2015). Even prior to the recognition of the genetic causes of RTT, clinical findings suggested the presence of metabolic abnormalities and more recently mitochondrial dysfunctions and the presence of a subclinical inflammatory status were identified as important contributors to the pathophysiology of RTT (Eeg-Olofsson 1988, 1990; Shulyakova 2017). In fact, it has been reported that mitochondria of muscle and frontal lobe biopsies from RTT patients present abnormal ultrastructure as determined by electron microscopy (Armstrong 1992, Bauman 1995). Furthermore, these observations were corroborated by gene expression profile of RTT patients and Mecp2-knockout mice samples showing impaired expression of genes required for mitochondrial structure, function and redox homeostasis (Filosa 2015, Pecorelli 2016). These defects were proposed to further contribute to the disease progression (Grosser 2012, Sbardella 2017). Besides the increased oxidative damage-related markers and reduced activity of the main antioxidant enzymes (Pecorelli et al., 2011; Cervellati et al., 2015), RTT patients show chronic subclinical inflammatory condition characterized by deregulation of acute phase response proteins and perturbed cytokine/chemokine profile (Cortelazzo et al., 2014; Leoncini et al., 2015; Pecorelli et al., 2016). Furthermore, RTT PBMCs present mitochondrial morphological abnormalities associated with up-regulation of arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15) mRNA, an enzyme implicated in the oxidation of polyunsaturated fatty acids including linoleic acid and generation of bioactive lipid metabolites such as hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs) (Pecorelli et al., 2016; Pecorelli et al., 2019). ALOX15 transcript levels are correlated to augmented serum levels of 13-HODE in RTT patients (Pecorelli et al., 2019). Even macrophage populations, including microglia, are dysregulated in Mecp2-null mice (Cronk et al., 2015; Schafer et al., 2015). A transcriptomic study on microglia from Mecp2-null female mice at pre-phenotypic and phenotypic stages revealed an impaired expression of genes associated with innate immunity and cellular stress responses, suggesting an early potential role of microglia in the later onset of neurological symptoms (Zhao et al., 2017). In this context, mitochondria can play a key role in fueling this positive feed-back cross-talk between altered redox homeostasis and increase inflammatory status (OxInflammation) RTT (Pecorelli et al., 2016). For instance, mitochondrial dysfunction is considered crucial for the activation of NLRP3 inflammasome, a multiprotein complex that mediates proinflammatory responses (Sandhir et al., 2017). As part of the innate immune defense, inflammasomes may play a crucial role in this chronic inflammatory condition. Inflammasomes are a group of intracellular multi-protein complexes assembled in response to different stimuli (both pathogens and sterile stressors) and characterized by the activation of inflammatory caspases (caspase-1, -4, -5, and -11), able to activate the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β and IL-18. A variety of distinct inflammasome complexes has been identified, however the best-characterized is NLRP3 complex, which comprises in its canonical form the sensor protein ‘NLR family pyrin domain containing 3’ (NLRP3), the adaptor protein ‘apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain’ (ASC), and the effector protein pro-caspase-1 (Liu et al., 2020). NLRP3 inflammasome is generally activated through a two-step process. During the priming step (signal 1), upon the activation of different receptors (e.g., TLR4) induced by pathogen- or damage-associated molecular patterns (PAMPs and DMAPs, respectively), NF-κB translocates to the nucleus, where it can transcribe for several genes including NLRP3, pro-IL-1β, and pro-IL-18. The activation of NLRP3 can occur through a multitude of signals (PAMPs/DAMPs, potassium efflux, lysosomal-damaging environmental factors, and endogenous factors, like excessive ROS production and mitochondrial damage), leading to the assembly of the machinery and the autocatalytic cleavage of pro-caspase-1 into its active form (signal 2). Caspase-1 not only is responsible for the activation and release of IL-1β and IL-18, it can also cleave gasdermin D protein and its N-terminal fragment that can create pores into the plasma membrane and eventually trig a pro-inflammatory type of cell death known as pyroptosis (Liu et al., 2020). The assembly of NLRP3 inflammasome system leads to a cascade of events able to promote a multitude of finely regulated immune responses useful for restoring the physiological conditions. However, an uncontrolled and prolonged inflammasome activation can participate in the onset and progression of chronic inflammatory states associated with several human diseases (such as cancer, gout, type II diabetes, neurodegenerative diseases, and autism) (Saresella et al., 2016; Moossavi et al., 2018; Song et al., 2017). We have recently found a dysregulated inflammasome activation in primary cells obtained from RTT patients (Pecorelli et al., 2020; Cordone et al., 2022). Interestingly, increased plasma levels of IL-1β and IL-18 showed, respectively, positive correlation with MECP2 mutation severity and negative correlation with the stage of the pathology, suggesting a role for an aberrant inflammasome response in RTT pathophysiology, even in the early stages of disease (Cordone et al., 2022). Based on literature and the above-described findings, we hypothesize that altered mitochondrial dynamics and a constitutive hyperactivated status of NLRP3 inflammasome may play a critical role in the ‘OxInflammatory’ condition typical of RTT. In particular, in this project, we want demonstrated their contributing role in the shift from the pre-symptomatic to symptomatic stage characteristic of RTT. In this context, future investigations on therapeutics that address mitochondrial dysfunction have a potentially broad clinical impact on RTT since altered mitochondrial dynamics and inflammasome activation are causatively related events. In fact, defective mitochondrial dynamics promotes mitochondrial localization of NLRP3 and activation of the inflammasome (Mishra et al., 2021). Therefore, treatments that restore the mitochondrial homeostasis, and the subclinical inflammatory status could be key targets to improve patient outcome.