MINI-HEART - Processo innovativo per la terapia personalizzata delle cardiomiopatie dilatative geneticamente determinate attraverso l’utilizzo di modelli 3D di tessuti cardiaci umani ingegnerizzati

La cardiomiopatia dilatativa (DCM) non ischemica è tra le forme più comuni di malattia cardiaca, e una delle principali cause di insufficienza cardiaca. È una malattia complessa e multifattoriale, ma in circa 30-40% dei casi è determinata da singoli difetti genetici, principalmente nei geni che codificano per componenti strutturali dei cardiomiociti (cardiomiopatia dilatativa geneticamente determinata – DCMgd). Tali difetti genetici sono riscontati sia in forme familiari che in forme sporadiche. Tuttavia, le implicazioni terapeutiche e prognostiche rimangono poco chiare a causa della limitata disponibilità di dati e l’assenza di modelli in vitro nella ricerca preclinica. Date queste premesse, il progetto MINI-HEART propone di sviluppare un processo terapeutico innovativo per la Cardiomiopatia Dilatativa (DCM) basato sulla diagnosi genetica e terapia personalizzata, attraverso l’implementazione, nel protocollo terapeutico, di un passaggio che prevede l’utilizzo di un modello in vitro, i cosiddetti “mini-cuori” umani, derivanti dai pazienti stessi e su cui effettuare sia la diagnostica genetica, sia uno screening terapeutico in modo da ottenere una terapia personalizzata con alto tasso di efficacia. Il nuovo processo sarà costituito da diverse fasi: 1) Al manifestarsi dei primi sintomi (o anche prima, in presenza di familiarità per DCM), il paziente viene sottoposto a un’analisi genetica avanzata per identificare eventuali mutazioni patogenetiche. Vengono riprogrammate le cellule del paziente in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), differenziate in cardiomiociti funzionali in vitro, creando un modello personalizzato del cuore del paziente, attraverso modelli 3D che riproducano fedelmente la complessità strutturale, cellulare e funzionale del tessuto cardiaco del paziente (MINI-HEART). Questo modello permette di studiare la risposta del cuore del paziente ai diversi farmaci, in una modellizzazione tridimensionale del tutto sovrapponibile come architettura e fisiologia all’organo cardiaco, evitando trattamenti inefficaci o dannosi. I cardiomiociti derivati dal paziente vengono esposti a diverse classi di farmaci per identificare il trattamento più efficace e sicuro in base alla specifica mutazione genetica; questo screening consente di predire la risposta clinica, riducendo il rischio di effetti avversi e fallimenti terapeutici. Inoltre, i farmaci vengono selezionati in modo mirato, introducendo così un approccio personalizzato, anziché affidarsi a protocolli standardizzati. La personalizzazione della terapia permette di intervenire in modo proattivo, adattando il trattamento prima che la funzione cardiaca si deteriori significativamente. In caso di DCM familiare, l’analisi genetica permette di identificare precocemente i parenti a rischio, anche prima della comparsa dei sintomi. Per i soggetti con mutazioni patogenetiche ma ancora asintomatici, si possono attuare strategie di prevenzione mirate, come una sorveglianza clinica più stretta o terapie precoci per ritardar l’insorgenza della malattia. Questo approccio riduce il numero di pazienti che progrediscono fino alla fase avanzata della DCM, migliorando complessivamente la prognosi. Questi obiettivi puntano a una convergenza tra tecnologia avanzata, ricerca biomedica e applicazioni industriali, con l’obiettivo di migliorare la salute umana e ridurre i costi associati allo sviluppo di nuove terapie. Infatti, il modello dei mini-cuori tridimensionali potrà essere utilizzato da gruppi di ricerca e da terzi potenzialmente interessati, quali aziende farmaceutiche e strutture sanitarie come una "piattaforma in vitro personalizzata per i pazienti" per un approccio integrato e multilivello, al fine di determinare le specifiche caratteristiche cellulari e molecolari associate a ciascun genotipo patogenetico, in termini di proprietà elettriche e meccaniche e marker molecolari, correlando queste con gli esiti clinici predefiniti nei pazienti affetti. Combinando indicatori di flussi di calcio ed elettrici geneticamente codificati con la microscopia laser-confocale e la mappatura ottica, saranno analizzate le proprietà elettrofisiologiche e di gestione del calcio dei “mini-cuori” a risoluzione cellulare e tissutale. Il modello 3D di tessuto cardiaco sviluppato nel progetto MINI-HEART è un eccezionale sistema avanzato che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) derivate da pazienti con mutazioni genetiche specifiche. Questo modello ricrea in vitro l'organizzazione del tessuto cardiaco umano, riproducendo fedelmente le caratteristiche cliniche e molecolari della cardiomiopatia, simulando la tensione e il movimento dinamico del miocardio e riproducendo le condizioni di carico meccanico reale. Grazie a una combinazione di tecnologie avanzate, come l'utilizzo di marcatori molecolari e strumenti di analisi elettrofisiologica, il modello permette di studiare i meccanismi cellulari e molecolari della malattia e di testare interventi terapeutici mirati, inclusi approcci di gene editing. È stato progettato per fornire un'accurata rappresentazione della patologia e per correlare i parametri cellulari con le caratteristiche cliniche dei pazienti, rappresentando così una piattaforma preclinica unica per la ricerca e lo sviluppo di terapie innovative. Inoltre, questo tipo di modello, consente test automatizzati su larga scala per identificare potenziali farmaci con effetti cardiaci specifici e, mantenendo in coltura funzionalità e vitalità per periodi prolungati, permette valutazioni predittive più affidabili degli effetti cardiotossici di nuovi farmaci rispetto ai modelli animali o bidimensionali. I modelli cardiaci 3D, quindi, combinano complessità strutturale, funzionalità e personalizzazione, diventando strumenti cruciali per lo studio delle malattie cardiovascolari, lo sviluppo di nuove terapie e la riduzione dei rischi nei test preclinici. Questa nuova tecnologia potrà essere utilizzata per svelare i meccanismi molecolari e cellulari d’insorgenza e progressione della malattia, effettuare screening di farmaci convenzionali in grado di sollevare il quadro clinico dei pazienti, ed infine testare approcci innovativi e personalizzati di gene editing per correggere i difetti genetici associati alla DCMgd, in vista di una possibile reversione del fenotipo patologico. Quest’ultimo approccio rappresenterebbe la più innovativa frontiera per il trattamento di questa come di altre patologie genetiche da varianti monogeniche, traendo vantaggio dalla rapida evoluzione dei sistemi di veicolazione in vivo di molecole a scopo terapeutico basata sulla tecnologia di nanoparticelle lipidiche (Stable Nucleic Acid Lipid Particle - SNALP). In questo progetto, supereremo le attuali limitazioni dell’editing genetico preciso nel cuore mediante: i) l’adattamento della tecnologia di prime editing (PE), che consente la correzione genica indipendente dalla ricombinazione omologa (HR), per correggere mutazioni nei cardiomiociti; iii) lo sviluppo di nuove tecnologie di somministrazione genica basate su nanoparticelle lipidiche stabili per acidi nucleici (SNALP), che consentono l’introduzione di RNA di editor genetici di grandi dimensioni direttamente nel cuore. Questo progetto rappresenta, quindi, una forte innovazione nel settore. Ciò offrirà la possibilità senza precedenti di studiare le correlazioni genotipo-fenotipo in un sistema 3D, in grado di rivelare le principali caratteristiche della malattia in un sistema in vitro, permettendo quindi indagini molecolari, farmacologiche e innovativi approcci terapeutici.

Non-ischemic dilated cardiomyopathy (DCM) is among the most common forms of heart disease and one of the leading causes of heart failure. It is a complex and multifactorial disease, but in approximately 30-40% of cases, it is caused by single genetic defects, primarily in genes encoding structural components of cardiomyocytes (genetically determined dilated cardiomyopathy – DCMgd). These genetic defects are found in both familial and sporadic forms. However, therapeutic and prognostic implications remain unclear due to the limited availability of data and the absence of in vitro models in preclinical research. Given this premise, the MINI-HEART project aims to develop an innovative therapeutic approach for Dilated Cardiomyopathy (DCM) based on genetic diagnosis and personalized therapy. This will be achieved by implementing an in vitro model, the so-called “human mini-hearts”, derived from the patients themselves, on which both genetic diagnostics and drug screening can be performed. This approach will allow the development of a personalized therapy with a high success rate. The new process will consist of several phases: 1. At the onset of the first symptoms (or even earlier, in the presence of a family history of DCM), the patient undergoes advanced genetic analysis to identify possible pathogenic mutations. The patient’s cells are reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and differentiated into functional in vitro cardiomyocytes, creating a personalized heart model. These 3D models faithfully replicate the structural, cellular, and functional complexity of the patient’s cardiac tissue (MINI-HEART). • This model allows researchers to study how the patient’s heart responds to different drugs using a three-dimensional system that mimics the heart’s architecture and physiology. • Patient-derived cardiomyocytes are exposed to different drug classes to identify the safest and most effective treatment based on the specific genetic mutation. • This screening predicts clinical responses, reducing the risk of adverse effects and therapeutic failures. Instead of relying on standardized protocols, this personalized approach ensures targeted drug selection, preventing ineffective or harmful treatments. The ability to tailor therapy enables early intervention before significant cardiac deterioration occurs. 2. In cases of familial DCM, genetic analysis helps identify at-risk relatives before symptoms appear. For individuals carrying pathogenic mutations but still asymptomatic, preventive strategies such as closer clinical surveillance or early therapies can be implemented to delay disease onset. • This approach reduces the number of patients who progress to advanced DCM, improving overall prognosis. • The project aims to integrate advanced technology, biomedical research, and industrial applications to enhance human health while reducing drug development costs. The 3D “mini-heart” model can be used by research groups, pharmaceutical companies, and healthcare facilities as a personalized in vitro platform for patients. This will allow multi-level and integrated research, determining the cellular and molecular characteristics of each pathogenic genotype, including electrical and mechanical properties and molecular markers, correlating them with clinical outcomes in affected patients. By combining genetically encoded calcium and electrical flow indicators with laser-confocal microscopy and optical mapping, the electrophysiological and calcium-handling properties of the mini-hearts will be analyzed at both cellular and tissue resolution. A Cutting-Edge 3D Cardiac Model The MINI-HEART project’s 3D cardiac tissue model is an advanced system that utilizes human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) derived from patients with specific genetic mutations. This model faithfully replicates the human heart’s clinical and molecular features in vitro, simulating myocardial tension and dynamic movement while reproducing real mechanical loading conditions. Thanks to advanced technologies such as molecular markers and electrophysiological analysis tools, it enables: • The study of cellular and molecular disease mechanisms • The testing of targeted therapeutic interventions, including gene editing approaches Designed to accurately represent the pathology, this model correlates cellular parameters with clinical patient characteristics, making it a unique preclinical platform for research and innovative therapy development. Additionally, the 3D cardiac model enables automated large-scale drug testing to identify potential cardiac-specific drugs. By maintaining functional and viable cultures for extended periods, it provides more reliable predictive assessments of cardiotoxic effects compared to animal or 2D models. Future Perspectives: A New Frontier in Cardiovascular Research 3D cardiac models combine structural complexity, functionality, and personalization, making them crucial tools for cardiovascular disease research, drug development, and risk reduction in preclinical testing. This technology can be used to: • Unravel molecular and cellular mechanisms of disease onset and progression • Screen conventional drugs that may improve patients’ clinical conditions • Test innovative and personalized gene-editing approaches to correct genetic defects associated with DCMgd, potentially reversing the pathological phenotype This last approach represents the most innovative frontier in treating monogenic genetic diseases, leveraging the rapid evolution of in vivo delivery systems for therapeutic molecules, such as lipid nanoparticle technology (Stable Nucleic Acid Lipid Particle - SNALP). Overcoming Current Limitations in Cardiac Gene Editing In this project, we will overcome current barriers in precise cardiac gene editing through: 1. Adapting Prime Editing (PE) technology, which allows gene correction independently of homologous recombination (HR), to repair mutations in cardiomyocytes. 2. Developing new gene delivery technologies based on stable nucleic acid lipid nanoparticles (SNALP) to introduce large genetic editor RNAs directly into the heart. A Groundbreaking Innovation in the Field This project represents a significant innovation in cardiovascular medicine. By enabling unprecedented genotype-phenotype correlation studies in a 3D system, it will provide valuable insights into disease characteristics, enabling molecular investigations, pharmacological screening, and novel therapeutic strategies.