Development of biocompatible and sustainable enzyme mimicking compounds

Nonostante i numerosi vantaggi dell'uso degli enzimi come catalizzatori, tra cui l'elevata selettività e lo stereocontrollo, la loro applicazione su larga scala è limitata da diversi inconvenienti: la bassa stabilità termica e la tolleranza a diverse condizioni sperimentali, la scarsa versatilità dei substrati, l'inadeguatezza alle reazioni abiotiche e l'elevato costo di purificazione. Nel tentativo di superare queste vulnerabilità, da tempo si studiano i mimi enzimatici (EMs). Lo sviluppo di EMs efficienti rappresenta una formidabile opportunità sulla strada di una transizione verde e di un alto grado di innovazione competitiva, entrambi necessari per la nostra prosperità e il nostro benessere. In particolare, negli ultimi anni, i progressi della ricerca sugli EM hanno portato a significativi sviluppi di protocolli di sintesi chimica sostenibile, sia a livello di laboratorio che di scala industriale. Questi composti hanno il potenziale per competere con gli enzimi naturali e i catalizzatori “classici”, trovando applicazione in un'ampia gamma di campi, dall'industria chimica e alimentare alla diagnostica e alla medicina o alla produzione di carburanti e idrogeno gassoso. Gli EM sono solitamente progettati per riprodurre i siti catalitici degli enzimi naturali, seguendo due possibili approcci: imitare la funzionalità dell'enzima utilizzando complessi metallici con attività simile, oppure imitare la struttura del sito attivo dell'enzima introducendo gruppi funzionali appropriati (ad esempio, oligopeptidi). Il presente progetto di ricerca (EnzyMime) mira a progettare una nuova classe di EM de novo, basata su peptidi sintetici ramificati. Uno scaffold centrale biocompatibile (Schema 1) rappresenta il nucleo della struttura dell'EM, al quale sono collegati quattro oligopeptidi identici attraverso la cosiddetta “tecnologia di saldatura dei peptidi” (PWT). Ciò consentirà di sviluppare facilmente diversi EM, in cui il potenziale sito catalitico può essere prodotto introducendo sequenze amminoacidiche appropriate, in grado di legare gli ioni metallici attivi. Un esempio può essere rappresentato dalla sintesi di diversi surrogati di Cu/Zn-SOD, Mn-SOD e Ni-SOD per catalizzare la dismissione dei radicali superossido. L'approccio sperimentale consisterà in: sintesi di diversi EM e loro caratterizzazione catalitica; caratterizzazione completa dei sistemi metallo/peptide più promettenti, attraverso potenziometria, voltammetria, spettrofotometria, spettrofluorimetria, spettrometria di massa, risonanza magnetica nucleare, risonanza paramagnetica elettronica, calcoli teorici e indagini strutturali mediante cristallografia a raggi X. Per favorire la cristallizzazione dei peptidi e dei loro complessi metallici, alle sequenze chelanti è stato aggiunto uno spaziatore contenente una breve sequenza di ripiegamento ad alfa-elica. Infine, per esplorare alcune possibili applicazioni pratiche nel campo della salute e del benessere umano, saranno eseguiti test biologici, tra cui la stabilità enzimatica nel plasma umano, l'interazione con gli acidi nucleici, la citotossicità contro le cellule tumorali, la mobilità attraverso diversi tipi di membrane e l'attività antimicrobica.

Despite the many advantages of the use of enzymes as catalysts, including high selectivity and stereocontrol, their large-scale application is limited by several drawbacks: low thermal stability and tolerance to different experimental conditions, poor substrate versatility, unsuitability to abiotic reactions and high cost of purification. As an attempt to overcome such vulnerabilities, enzyme mimics (EMs) has been investigating since long time. The development of efficient EMs represents a formidable opportunity on the way of a green transition and a high grade of competitive innovation, both needful for our prosperity and wellbeing. Notably, in recent years, the research progress on EMs has led to significant developments of sustainable chemical synthesis protocols, at both laboratory and industrial scale level. These compounds have the potential to compete with natural enzymes and “classical” catalysts, finding application in a wide range of fields, from chemical and food industries to diagnostics and medicine or production of fuels and gaseous hydrogen. EMs are usually designed to reproduce the catalytic sites of natural enzymes, following two possible approaches: imitating the enzyme functionality using metal complexes with similar activity, or mimicking the structure of the enzyme active site by introducing appropriate functional groups (e.g.: oligopeptides). The present research project (EnzyMime) aims at designing a new class of de novo EMs, based on synthetic branched peptides. A biocompatible central scaffold (Scheme 1) represents the core of the EM structure, to which four identical oligopeptides are linked through the so-called “peptide welding technology” (PWT). This will allow the easy development of different EMs, where the potential catalytic site can be produced introducing appropriate amino acid sequences, able to bind the active metal ions. An example may be represented by the synthesis of different surrogates of Cu/Zn-SOD, Mn-SOD and Ni-SOD to catalyse dismutation of superoxide radicals. The experimental approach will consist of: synthesis of several EMs and their catalytic characterization; complete characterization of the most promising metal/peptide systems, through potentiometry, voltammetry, spectrophotometry, spectrofluorimetry, mass spectrometry, nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance, theoretical calculations and structural investigation by X-ray crystallography. To help the crystallization of peptides and their metal complexes, a spacer containing a short alpha-helix folding sequence will also been added to the chelating sequences. Finally, in order to explore some possible practical applications in the field of human health and wellbeing, biological tests will be performed, including enzymatic stability in human plasma, interaction with nucleic acids, cytotoxicity against cancer cells, mobility through different types of membranes and antimicrobial activity.