Prot. 2022J2WJC3 - Decipher how ubiquitylation shapes membrane and membraneless organelles to promote neuronal homeostasis

Un segno distintivo delle cellule eucariotiche è l'evoluzione dei compartimenti subcellulari per garantire che specifiche reazioni biochimiche e funzioni cellulari avvengano in modo spazialmente limitato. Storicamente, si pensava che solo gli organelli legati alla membrana, specificati dalla loro composizione unica di fosfolipidi, confinassero una serie specializzata di molecole in diversi compartimenti subcellulari. Studi recenti hanno rivoluzionato questo punto di vista: la condensazione biomolecolare guidata dalla separazione di fase liquido-liquido è emersa come una strategia essenziale per confinare diverse funzioni cellulari. Con la rapida identificazione di diversi compartimenti privi di membrana arriva un'esplosione simile di domini distinti tra il reticolo endoplasmatico (ER) e altri organelli, noti come siti di contatto con la membrana, che funzionano come hub di segnalazione. È interessante notare che questi due tipi di strutture interagiscono intimamente e le loro azioni coordinate assicurano il controllo spaziotemporale di varie funzioni cellulari. La natura dinamica di questi compartimenti richiede un adattamento rapido e flessibile. L'ubiquitilazione è un processo ancora non caratterizzato per tale regolamentazione, e i nostri dati pubblicati e non pubblicati supportano questa ipotesi. In questa proposta intendiamo chiarire come l'ubiquitilazione delle ribonucleoproteine (RNP) e dei siti di contatto ER governi l'omeostasi neuronale. Ci concentreremo sulle ligasi E3 dell'ubiquitina: HECW1, CRL3KLHL12 e TRIM18 che sono i membri prototipici delle principali classi di E3 e studieremo la loro capacità di modificare e modulare le componenti integrali dei due compartimenti. Il progetto è strutturato in workpackages: WP1 affronta la caratterizzazione biochimica e biofisica degli enzimi E3 e dei loro substrati (FMRP, alpha4/PP2A) coinvolti nella regolazione dell'RNP. WP2 mira a caratterizzare due proteine ubiquitilate chiave ER-residenti (Lunapark e RTN3) dissezionando il meccanismo e la funzione della loro ubiquitilazione. Il WP3 sfrutta le conoscenze acquisite nel WP1 e nel WP2 per analizzare il ruolo di queste reti di ubiquitina nel controllo della traduzione locale e della degradazione nei neuroni. Ci concentreremo sui neuroni poiché queste cellule altamente polarizzate hanno una richiesta aggiuntiva di risposte rapide e quindi di macchinari pronti all'uso e sono altamente suscettibili alle alterazioni del processo di ubiquitilazione. Affrontando questi problemi, ci aspettiamo di fornire progressi in: i) il ruolo dell'ubiquitilazione nella compartimentazione cellulare dinamica e ii) il ruolo dell'ubiquitilazione nella sintesi proteica periferica neuronale. Comprendere le relazioni funzionali tra il macchinario dell'ubiquitina, gli RNP e i siti di contatto ER e sondare i risultati ottenuti nei neuroni ci consentirà di contestualizzare la loro funzione in modo fisiologicamente significativo e di applicare tali principi all'intervento sulla malattia.

A hallmark of eukaryotic cells is the evolution of subcellular compartments to ensure that specific biochemical reactions and cellular functions occur in a spatially restricted manner. Historically, only membrane-bound organelles, specified by their unique composition of phospholipids, were thought to confine a specialized array of molecules to different subcellular compartments. Recent studies have revolutionized this view: biomolecular condensation driven by liquid-liquid phase separation has emerged as an essential strategy to confine diverse cellular functions. With the rapid identification of different membraneless compartments comes a similar explosion of distinct domains between the Endoplasmic Reticulum (ER) and other organelles, known as membrane contact sites, which work as signaling hubs. Intriguingly, these two types of structures interact intimately and their coordinated actions ensure spatiotemporal control of various cellular functions. The dynamic nature of these compartments requires rapid and flexible adaptation. Ubiquitylation is an exciting and yet uncharacterized candidate for such regulation, and our published and unpublished data sustain this hypothesis. In this proposal we intend to elucidate how ubiquitylation of Ribonucleoproteins (RNPs) and ER contact sites governs neuronal homeostasis. We will focus on selective ubiquitin E3 ligases: HECW1, CRL3KLHL12 and TRIM18 that are the prototypic members of the main classes of E3s and we will investigate their ability to modify and modulate integral components of the two compartments. The project is structured in work packages:
WP1 (Ubiquitin modulates RNPs) tackles the biochemical and biophysical characterization of the E3 enzymes and their substrates (FMRP, alpha4/PP2A) that are involved in RNP regulation.
WP2 (Ubiquitin modulates ER contact sites) aims at characterizing two key ubiquitylated ER-resident proteins (Lunapark and RTN3) by dissecting the mechanism and the function of their ubiquitylation. WP3 (Ubiquitin modulates local protein synthesis and autophagy in neurons) exploits the knowledge acquired in WP1 and WP2 to analyse the role of these ubiquitin networks in controlling local translation and degradation in neurons. We will focus on neurons as these highly polarized cells have an additional demand for rapid responses and thus, ready-to-use machineries and they are highly susceptible to alterations of the ubiquitylation process. By addressing these issues, we expect to provide advancement in: i) the role of ubiquitylation in dynamic cellular compartmentalization and ii) the role of ubiquitylation in neuronal peripheral protein synthesis.
Understanding the functional relationships between the ubiquitin machinery, the RNPs and ER contact sites, and probing the results obtained in neurons will allow us to contextualize their function in a physiologically meaningful manner and apply those principles to disease intervention.