FIS-2023-02024 - DipRec - A DNA-nanotechnology-based multi-integrated platform to study membrane receptors oligomerization within ordered cell membrane domains

I lipid rafts sono domini di membrana ordinati su scala nanometrica, arricchiti in sfingolipidi e colesterolo, che svolgono un ruolo importante nel traffico di membrana e nella trasduzione del segnale, favorendo la colocalizzazione dei recettori di membrana. Questo determina un’organizzazione definita dei recettori e modula la rete di segnalazione. Nonostante anni di studi, il loro ruolo rimane oggetto di dibattito. Questo progetto mira a sviluppare una piattaforma multi-integrata basata su nanotecnologie a DNA per studiare i nano-intorni dei recettori all’interno dei lipid rafts e chiarire il loro ruolo nella clusterizzazione dei recettori. L’approccio combina RepliSeq (un nuovo metodo basato su DNA per la mappatura nanoscopica delle proteine di membrana) con tecniche biofisiche (SPR, NanoIR) e di microscopia (EM, FIB). Il recettore Her2, rilevante nei tumori al seno aggressivi, verrà utilizzato come modello per comprendere come la sua distribuzione nei lipid rafts influenzi l’oligomerizzazione e la risposta alle terapie mirate. Obiettivo 1: Indagare il legame tra la formazione dei lipid rafts e l’oligomerizzazione di Her2 in membrane artificiali (bilayer lipidici supportati, SLB). Verranno creati SLB arricchiti in lipid rafts e funzionalizzati con nanostrutture di DNA per posizionare e rilevare con precisione le proteine di interesse. Il sistema mira a valutare se variazioni in dimensione/composizione dei rafts influenzano l’omo-/etero-oligomerizzazione di Her2. L’intero setup sarà caratterizzato tramite microscopia a fluorescenza, AFM, SPR e NanoIR. Obiettivo 2: Esaminare la localizzazione di Her2 nei lipid rafts in linee cellulari tumorali mammarie, prima e dopo trattamento con terapia mirata. RepliSeq sarà usato per mappare l’organizzazione spaziale di Her2 e le sue interazioni con membri della famiglia EGFR, anche in modelli cellulari resistenti. Infine, tecniche ad alta risoluzione come EM e tomografia elettronica (FIB-EM/ET), combinate con marcatura fluorescente, permetteranno di visualizzare la clusterizzazione di Her2 e l’ultrastruttura del suo intorno di membrana.

Lipid rafts are nanoscale ordered membrane domains enriched in sphingolipids and cholesterol and play an important role in cell membrane trafficking and signal transduction by promoting the colocalization of membrane receptors, hence determining a defined receptor organization and modulating the signalling network. Despite years of study, their role remains debated. This project aims to develop a multi-integrated DNA nanotechnology platform to study receptor nanoenvironments within lipid rafts and clarify their role in receptor clustering. The approach combines RepliSeq (a new DNA-based tool for nanoscale mapping of membrane proteins) with biophysical (SPR, NanoIR) and microscopy (EM, FIB)techniques. The Her2 receptor, relevant in aggressive breast cancers, is used as a model to understand how its distribution in lipid rafts affects oligomerization and target therapy response. Aim 1: Investigate the link between lipid raft formation and Her2 oligomerization inartificial membranes (Supported Lipid Bilayers, SLBs). Raft-enriched SLBs will be created and functionalized with DNA nanostructures to precisely place and detect proteins of interest. The system will assess whether changes in raft size/composition influence Her2 homo-/hetero-oligomerization. The setup will be characterized via fluorescence microscopy, AFM, SPR, and NanoIR. Aim 2: Examine Her2 localization within lipid rafts in breast cancer cell lines, before and after target therapy treatment. RepliSeq will map Her2 spatial organization and its interactions with EGFR family members, including in resistant cell models. Finally, high-resolution EM and electron tomography (FIB-EM/ET), combined with fluorescent labeling, will visualize Her2 clustering and the ultrastructure of its membrane environment.